摘要

液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)是一種準(zhǔn)確測(cè)定核酸的方法。本前研究的目的是利用ddPCR評(píng)價(jià)慢性髓系白血病(CML)患者的微小殘留病(MRD)?；颊呒胺椒ǎ?/span>2013年5月至2014年11月，采用尼洛替尼治療的CML患者被納入研究。在第一次*分子反應(yīng)(CMR)時(shí)使用ddPCR評(píng)估BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本水平。我們招募了來(lái)自7個(gè)機(jī)構(gòu)的15名患者。治療期為45個(gè)月和47個(gè)月。結(jié)果：高水平BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本的患者在隨訪期間更容易失去CMR (p=0.095)。此外，BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平低的患者與高水平患者相比，CMR持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)(p=0.032)。結(jié)論:ddPCR是一種靈敏的檢測(cè)MRD的方法，MRD可影響治療反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。

慢性髓系白血病(CML)的細(xì)胞遺傳學(xué)特征是t(9;22)(q34;q11.2)，產(chǎn)生BCR/ABL1融合癌基因。自人類第一種靶向藥物伊馬替尼成功以來(lái)，更有效的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)，如達(dá)沙替尼和尼洛替尼被引入CML的一線治療，并顯示76~82%的主要分子應(yīng)答率。CML現(xiàn)在被認(rèn)為是一種終身疾病，5年總生存率>90%。以前的報(bào)道已經(jīng)證明，早期分子反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)是改善預(yù)后的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此，歐洲白血病網(wǎng)指南建議的最佳響應(yīng)百分比BCR/ ABL1融合轉(zhuǎn)錄本在國(guó)際規(guī)模(BCR / ABL1) < 10%，初始治療后3個(gè)月，緊隨其后的是<1%，6個(gè)月和12個(gè)月，0.1%使用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRTpcr)。此外，最近的證據(jù)表明，深度分子反應(yīng)(DMR)的成就，包括MR4 (BCR/ABL1 IS≤0.01%)或MR4.5 (BCR/ABL1IS≤0.0032%)，是良好生存和無(wú)治療緩解的替代標(biāo)志。選擇達(dá)到DMR的患者可以嘗試停用TKIs，以改善他們的生活質(zhì)量和緩解經(jīng)濟(jì)壓力。雖然qRT-PCR通常用于常規(guī)監(jiān)測(cè)，但需要額外的敏感方法來(lái)檢測(cè)微小殘留疾病(MRD)。摘要液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)可對(duì)核酸進(jìn)行精確定量。由于其陽(yáng)性結(jié)果，它已被用于檢測(cè)血液病的MRD。在CML中，ddPCR已被驗(yàn)證用于精確測(cè)量BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本。我們假設(shè)，與傳統(tǒng)的qRT-PCR相比，ddPCR在檢測(cè)DMR患者的癌轉(zhuǎn)錄本水平方面更敏感。因此，本研究的目的是利用ddPCR對(duì)尼洛替尼治療的CML患者進(jìn)行MRD評(píng)價(jià)，這些患者首先通過(guò)qRT- PCR獲得了*分子反應(yīng)(CMR)。我們還評(píng)估了ddPCR陽(yáng)性與患者預(yù)后的關(guān)系。

患者及方法患者特點(diǎn)：

從2013年5月到2014年11月，我們前瞻性地納入了費(fèi)城染色體(Ph)陽(yáng)性CML慢性期患者，這些患者在尼洛替尼治療期間獲得了CMR。所有患者均采用尼洛替尼300 mg，每日2次作為一線靶向治療。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)與開(kāi)放標(biāo)簽、多機(jī)構(gòu)4期ENESTKorea試驗(yàn)相同。本研究包括被診斷為ph陽(yáng)性慢性粒細(xì)胞白血病的成年患者。在入組前6個(gè)月內(nèi)，通過(guò)至少20個(gè)骨髓中期細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)分析證實(shí)了診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：i)非典型BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本的CML(轉(zhuǎn)錄本不包括e13a2或e14a2，ii)既往使用骨髓抑制藥物治療(羥基脲和阿納格列德除外)，iii)既往使用TKI治療超過(guò)兩周，iv)既往造血干細(xì)胞移植，v)既往放療涉及25%或以上骨髓組織，vi)細(xì)胞病理證實(shí)CML中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，vii)東部合作腫瘤組表現(xiàn)狀態(tài)≥3 (12)，viii)心臟異常，包括：a)糾正心電圖QT間期≥480毫秒，b)*左束支傳導(dǎo)阻滯，c)forever性起搏器植入，d)先天性長(zhǎng)QT綜合征，e)需要治療的快速心律失常病史，f)臨床上顯著的靜息性心動(dòng)過(guò)緩，g) 12個(gè)月內(nèi)有急性冠脈綜合征病史，h)失代償性充血性心力衰竭，ix)器官功能障礙，定義為：a)血清總膽紅素水平≥1.5×正常范圍上限(ULN)，b)肌酐≥1.5×ULN，c)天冬氨酸或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥2.5×ULN，d)淀粉酶或脂肪酶≥1.5×ULN，e)堿性磷酸酶≥2.5×ULN，與CML無(wú)直接關(guān)系，x) CML以外的活性和未受控制的惡性腫瘤，xi)高血壓或糖尿病未控制，xii)感染活躍且未控制，xiii)兩周內(nèi)接受大手術(shù)或前一次手術(shù)未*恢復(fù)，xiv)先天性或獲得性出血傾向，xv)胃腸吸收受損，xvi)小腸切除或搭橋手術(shù)史，xvii) 12個(gè)月內(nèi)有急性胰腺炎或慢性胰腺炎病史，xviii)同時(shí)服用強(qiáng)而不可替代的CYP3A4抑制劑或誘導(dǎo)性藥物、QT延長(zhǎng)劑或XDS衍生物，xix)任何其他不受控制的醫(yī)療狀況，可能存在重大的安全風(fēng)險(xiǎn)或危及研究治療的依從性。在入選ENESTKorea試驗(yàn)的患者中，我們選擇了隨訪期間獲得CMR的患者，在他們F獲得CMR時(shí)，我們可以使用ddPCR評(píng)估BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本的水平。通過(guò)qRT-PCR將CMR定義為不可檢測(cè)的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平。隨訪期間，對(duì)所有患者進(jìn)行評(píng)估，每3個(gè)月在中心實(shí)驗(yàn)室(韓國(guó)大田BML)進(jìn)行qRT -PCR，量化BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為BCR/ABL1 ^IS。本研究采用ENESTKorea試驗(yàn)的qRT-PCR方案。本研究使用的qRT -PCR的靈敏度為MR ^4.5。通過(guò)各機(jī)構(gòu)的醫(yī)療記錄審查收集臨床信息，包括患者人口特征、BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本水平和不良反應(yīng)(AEs)。

BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本水平測(cè)定-定量RT- PCR分析mRNA水平。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用SuperScript®III first-strand Synthesis (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)將分離的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。最終反應(yīng)體積為20 μl，加入總RNA1 μg。反應(yīng)混合物在50?C孵育50分鐘，然后加熱至85?C5分鐘停止反應(yīng)，然后在-20?C保存至下一步。逆轉(zhuǎn)錄后，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的2 μl為模板，進(jìn)行BCR/ABL1和BCR擴(kuò)增。使用SsoAdvanced™UniversalSYBR®Green Supermix (Bio Rad, Hercules, CA, USA)和CFX384Real- Time System thermocycler (伯樂(lè))在總?cè)莘e為15 μL的條件下進(jìn)行PCR。放大曲線包括在95?C變性30s，1個(gè)循環(huán)，然后在95?C變性15s，然后在65?C退火和延伸30s，45個(gè)循環(huán)。PCR完成后，使用熔化曲線分析檢測(cè)BCR/ABL1和BCR的擴(kuò)增模式。以每個(gè)樣本的閾值循環(huán)數(shù)(C_T)確定拷貝數(shù)，并與每個(gè)重組質(zhì)粒(包括BCR或BCR/ABL1擴(kuò)增區(qū))的7個(gè)不同拷貝數(shù)(從10⁶到10⁰拷貝)生成的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。BCR/ABL1的引物為5' -GATGCTGACCAACTCGTGTG-3 '為正向引物，5 ' -AACGAAAAGGTTGGGGTCA T-3 '為反向引物。BCR的引物為5 ' -TTCTGGACCACCTGAAAAGG-3 '為正向引物，5 ' -GCTCTGTCTCTTGCTGTCC-3 '為反向引物。

微滴體系。ddPCR的總體積為20 μl，包含10μl EvaGreen supermix (2×，伯樂(lè))，每個(gè)引物(最終濃度為150nM)，無(wú)DNase/ Rnase無(wú)菌水，以及不同體積稀釋的cDNA(40、20或5ng)實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度并定義閾值。引物序列如下，BCR正向引物：5 ' -TTC TGG ACC ACC TGA AAA GG-3 '，BCR反向引物：5' -TGC TCT GTC TCT TGC TGT CC-3 '，BCR/ABL1正向引物：5 ' -GA T GCT GAC CAA CTC GTG TG-3'，BCR/ABL1反向引物：5 ' -AAC GAA AAG GTT GGG GTC A T-3'。將每個(gè)ddPCR混合物裝入DG8液滴產(chǎn)生器(伯樂(lè))的每個(gè)樣品孔中，然后將70μl EvaGreen (伯樂(lè))的液滴產(chǎn)生油裝入DG8液滴產(chǎn)生器的每個(gè)油槽中。加藥槽被放置在QX200液滴發(fā)生器(伯樂(lè))中。當(dāng)液滴生成完成時(shí)，每口液滴槽中大約生成20,000個(gè)液滴。每個(gè)液滴孔中的液滴轉(zhuǎn)移到96孔PCR板(伯樂(lè))上，使用PX1PCR板封口器(伯樂(lè))在180℃下密封5s，然后進(jìn)行熱循環(huán)。PCR板置于C1000Touch擴(kuò)增儀(伯樂(lè))中進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)條件為：i)在95?C下5min，ii)在95?C下變性30s，40次循環(huán)，iii)在58?C下退火1min，iv)在4?C下5min，v)90?C下5min，vi) 4?C無(wú)限保持。所有PCR步驟均以2?C/s的變化進(jìn)行。無(wú)模板對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(由K562總RNA合成的cDNA)均包含在每項(xiàng)檢測(cè)中。

數(shù)字PCR。在熱循環(huán)之后，將包含液滴的PCR板加載到QX200液滴讀取器(伯樂(lè))上，使用多像素光子計(jì)數(shù)器識(shí)別evgreen熒光團(tuán)的每個(gè)液滴的熒光強(qiáng)度。這種檢測(cè)器讀取液滴，通過(guò)逐滴繪制熒光圖來(lái)識(shí)別那些包含(+)或不包含(-)目標(biāo)基因的液滴。我們只對(duì)熒光水平與背景熒光水平有顯著差異的樣本確定液滴為陽(yáng)性液滴。我們使用QuantaSoft 1.7.4版本軟件(伯樂(lè))測(cè)定靶基因的濃度，以copies/ μl為單位。

統(tǒng)計(jì)分析。分類變量的比較使用Fisher精確檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析治療反應(yīng)期。CMR持續(xù)時(shí)間定義為qRT-PCR檢測(cè)不到BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本(BCR/ABL1 ^IS =0%)的時(shí)間。MR ^4.5的持續(xù)時(shí)間定義為從F未檢測(cè)到BCR/ALB1(即ddPCR進(jìn)行當(dāng)天)到qRT-PCR檢測(cè)到MR ^4.5缺失(BCR/ABL1 IS =0.0032%)的時(shí)間。BCR/ALB1轉(zhuǎn)錄本水平的臨界值是使用40、20或5ng RNA測(cè)量的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本總水平的中位數(shù)(3.6拷貝/20μL)(表II)。研究議定書(shū)經(jīng)7家醫(yī)院的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基生物醫(yī)學(xué)研究宣言》確立的原則。所有患者均知情同意納入本研究。

結(jié)果

患者特點(diǎn)。2013年5月至2014年11月，來(lái)自7家機(jī)構(gòu)的15例患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)(圖1和表I)。共有110例患者的中位隨訪時(shí)間為22.7個(gè)月(范圍為0.1~54.2個(gè)月)，80例患者的中位隨訪時(shí)間為未達(dá)到CMR，分別為22.5個(gè)月(范圍=0.1~37.0個(gè)月)。15例納入研究的患者中位隨訪時(shí)間為47個(gè)月(39~61個(gè)月)。所有患者均接受尼洛替尼開(kāi)始劑量300mg，每日2次。中位患者年齡56歲(范圍=38~83歲)。男性10例(66.7%)，女性5例(33.3%)。

表Ⅰ.患者基線特征(n=15)

表Ⅱ.在IS0%時(shí)，ddPCR檢測(cè)BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平。

ddPCR：液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)，IS是：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

ddPCR檢測(cè)。我們測(cè)量了水平的BCR/ABL1和BCR記錄三次使用ddPCR CMR首先實(shí)現(xiàn)時(shí)，所驗(yàn)證中存在的中間值(表2)?？?/span>BCR/ABL1和BCR轉(zhuǎn)錄水平3.6拷貝/20μl(范圍= 1.2 ~6.8拷貝/20μl)和15758拷貝/20μl(范圍=1802~34140循環(huán)/20μl)。

ddPCR結(jié)果和治療結(jié)果。15例患者的中位治療和隨訪時(shí)間分別為45個(gè)月(37~55個(gè)月)和47個(gè)月(39~61個(gè)月)。除了一個(gè)病人改用伊馬替尼由于尼洛替尼引起的心血管事件而開(kāi)始使用尼洛替尼37個(gè)月后，14例患者繼續(xù)接受尼洛替尼治療。隨訪期間，所有患者均維持較大的分子反應(yīng)(BCR/ABL1^IS≤0.1%)。15例患者中，2例患者在隨訪期間失去CMR。1例患者持續(xù)CMR超過(guò)21.3個(gè)月后失去CMR, qRT-PCR檢測(cè)出0.002%的BCR/ABL1。另1例患者CMR丟失，維持20.5個(gè)月后BCR/ABL1檢測(cè)率為0.012%。然而，在最后的隨訪期間，他們沒(méi)有失去MMR(一個(gè)病人9個(gè)月，另一個(gè)病人在失去CMR后8個(gè)月)。在隨后的分析中，我們使用總BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平的中位數(shù)(3.6拷貝/20μl)作為臨界值。雖然高水平(>3.6拷貝/20μl)BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本的患者在隨訪期間有失去CMR的傾向，但低水平(0/10,0%)和高水平(2/5,40%)患者之間的CMR損失沒(méi)有顯著差異(p=0.095;表III)。通過(guò)ddPCR測(cè)量，低水平BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本患者的CMR持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)(2年持續(xù)CMR率:低水平為100%，高水平為37.5%，p=0.032;圖2A)。然而，從第一次CMR的第一天到MR^4.5損失的第一天，兩組之間沒(méi)有顯著差異(2年持續(xù)MR^4.5的比率:低水平100%vs高水平75.0%，p= 0.186;圖2B)。

圖2，Kaplan Meier圖表。(A)*分子反應(yīng)持續(xù)時(shí)間取決于用ddPCR檢測(cè)BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平(中位數(shù)：3.6拷貝/20 μL)。(B) qRT-PCR未檢測(cè)BCR/ABL1到MR^4.5缺失的周期。IS是:國(guó)際規(guī)模,MR^4.5:4.5 log減少時(shí)的分子反應(yīng)，ddPCR：液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)，qRT-PCR：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)。

表Ⅲ.隨訪期間CMR喪失的趨勢(shì)。

討論

MRD被認(rèn)為在各種癌癥中非常重要，因?yàn)橹委熀蟮突蜿幮訫RD與較長(zhǎng)的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和生存期相關(guān)，而DMR的成功預(yù)測(cè)了CML患者更好的臨床結(jié)果。由于戒斷臨床研究(即STIM和TWISTER研究)的顯著結(jié)果，適當(dāng)選擇陽(yáng)性CMR患者對(duì)于預(yù)測(cè)無(wú)治療緩解的成功非常重要。目前，qRT-PCR是監(jiān)測(cè)TKI反應(yīng)和MRD以及預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)的主要方法。qRT-PCR雖然相對(duì)敏感，但由于標(biāo)準(zhǔn)化程度低、勞動(dòng)強(qiáng)度大，存在一些局限性?？朔@些限制，最近新興技術(shù)，如下一代測(cè)序、下一代流和ddPCR，已經(jīng)應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療。其中，ddPCR是一種*的方法，其結(jié)果與qRT-PCR有很強(qiáng)的相關(guān)性。ddPCR可以在不需要參考標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下測(cè)量絕對(duì)拷貝數(shù)。此外，它可以檢測(cè)靈敏度超過(guò)10^-6的核酸，受抑制物質(zhì)、非靶RNA和非特異性擴(kuò)增的影響較小。由于這些優(yōu)點(diǎn)，ddPCR在癌癥研究中已被用于評(píng)估循環(huán)腫瘤DNA、突變和腫瘤負(fù)擔(dān)。ddPCR也被用于檢測(cè)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的MRD和預(yù)測(cè)預(yù)后。因此，ddPCR可能是qRT-PCR的最佳替代方式，然而，ddPCR的缺點(diǎn)，包括它的高成本，時(shí)間密集，和有限的數(shù)據(jù)在臨床設(shè)置，必須解決，以使其更廣泛的應(yīng)用。

我們的結(jié)果表明，ddPCR可以作為qRT-PCR的補(bǔ)充，作為檢測(cè)MRD的一個(gè)敏感工具。盡管qRT-PCR證實(shí)CMR狀態(tài)(BCR/ABL1^IS =0%)，但所有患者均通過(guò)ddPCR檢測(cè)到BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本。此外，我們注意到CMR的持續(xù)時(shí)間因MRD的不同而有顯著差異，這與F實(shí)現(xiàn)CMR時(shí)的ddPCR檢測(cè)結(jié)果一致。這一發(fā)現(xiàn)表明，低MRD是維持較長(zhǎng)緩解期的重要因素，與以前的研究結(jié)果一致。然而，由于我們所有的患者在使用TKIs治療期間都維持了主要的分子反應(yīng)，因此，ddPCR檢測(cè)到的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平升高是否作為治療失敗的臨床意義尚存疑問(wèn)。此外，由于尼洛替尼的治療反應(yīng)較好，大約80%的細(xì)胞遺傳學(xué)*緩解率，所有患者在隨訪期間可能保持最佳緩解。因此，為了評(píng)估長(zhǎng)期結(jié)果，可能需要進(jìn)一步的隨訪。本研究的另一個(gè)局限性是我們不能常規(guī)使用ddPCR每3個(gè)月進(jìn)行反應(yīng)監(jiān)測(cè)。由于ddPCR尚未廣泛商業(yè)化，ddPCR的頻繁使用受到限制。另外，一些患者根據(jù)輸入RNA的結(jié)果不均勻，這也是另一個(gè)限制。利用ddPCR定量檢測(cè)BCR/ABL1的標(biāo)準(zhǔn)尚未確立。因此，有一個(gè)協(xié)調(diào)一致的努力，以獲得精確的結(jié)果與更少的假陽(yáng)性液滴(例如，使用足夠的cDNA體積)。然而，先前的一項(xiàng)研究表明，即使使用健康的捐贈(zèng)者，假陽(yáng)性率也可以達(dá)到2%。因此，為了提高ddPCR的敏感性，需要進(jìn)一步規(guī)范和驗(yàn)證方案。

我們研究的另一個(gè)局限性是，盡管這是一個(gè)多機(jī)構(gòu)的研究，但樣本量小。因此，需要一項(xiàng)大規(guī)模的研究來(lái)證實(shí)這些結(jié)果。盡管有這些局限性，但據(jù)我們所知，這是第一個(gè)報(bào)道CMR狀態(tài)的CML患者中，根據(jù)ddPCR測(cè)量的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果存在差異的研究?？傊?，我們證明了在CML患者中使用ddPCR檢測(cè)無(wú)法檢測(cè)到BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本時(shí)的MRD的敏感性，正如qRT-PCR所測(cè)量的那樣。此外，CMR持續(xù)時(shí)間因MRD的不同而有顯著差異。要將ddPCR廣泛應(yīng)用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和MRD檢測(cè)，還需要進(jìn)一步的大規(guī)模試驗(yàn)和嚴(yán)格驗(yàn)證。

結(jié)論